| 产品编号 | 包装单位 | 单价(元) | 交货期 | 询价单 |
| 4002571 | 250U | 询价 | 2-5天 | |
| 4002571 | 250Units | 询价 | 2-5天 | |
| 4002571 | 1000Units | 询价 | 2-5天 | |
| 4002571 | 1000U | 询价 | 2-5天 |
Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达5 kb(简单模板)。延伸速度为2min/kb(70～75℃，简单模板可达20s/kb)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，扩增产物具有平末端。
产品组成
| Component | P1021 250U | P1022 250U | P1023 1,000U | P1024 1,000U |
| Pfu DNA聚合酶(5U/μl) | 50 μl | 50 μl | 200 μl | 200 μl |
| 10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)[1] | 1.25 ml | 1.25 ml | 1.25 ml × 2 | 1.25 ml × 2 |
| 6× Loading Buffer[2] | 1 ml | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| dNTPs(2.5mM)[3] | - | 1 ml | - | 1 ml × 2 |
[1] 10× Pfu Buffer分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装，可方便选择。如无特别说明提供10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus)。Mg2+ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2。
[2] 6× Loading Buffer，如有需要可单独购买(Cat. #：M9041)。
[3] dNTPs是dATP、dGTP、dCTP和dTTP等摩尔混合物，P1021/P1023不含dNTPs，如有需要请单独购买(Cat. #：P9011/P9012/P9013)。
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存条件
-20℃保存2年。
质量控制
纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测：PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。
应用举例
1. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系，体系大小与组分用量与添加顺序可调整：
| Ordinal | Component | Volume (50 μl reaction volume) | Final concentration (50 μl reaction volume) |
| 1 | 10× Pfu Buffer(Mg2+ Plus) | 5 μl | 1× |
| 2 | dNTPs(2.5mM) | 4 μl | 0.4 mM |
| 3 | upstream primer (10 μM)[1] | 2 μl | 0.4 μM |
| 4 | downstream primer (10 μM)[1] | 2 μl | 0.4 μM |
| 5 | Pfu DNA聚合酶(5U/μl)[2] | 0.5 μl-1 μl | 2.5U-5U |
| 6 | template DNA[3] | 1-4 μl | <1μg |
| 7 | 超纯水[4] | To 50 μl | - |
| optional | MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5] | Variable | - |
[1] 引物终浓度建议范围：0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。
[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。
[3] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)。
| Template | Dosage |
| 人类基因组DNA | 0.1μg-1μg |
| λDNA | 0.5ng-5ng |
| 大肠杆菌基因组DNA | 10ng-100ng |
| 质粒DNA | 0.1ng-10ng |
[4] 可单独订购超纯水(Cat. #：P9021/P9022/P9023)。
[5] 可单独订购25mM MgCl2(Cat. #：P9031)和PCR Enhancer(Cat. #：P9041)。
2. 设定反应程序进行PCR反应
| Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
| Initial Denaturation | 94℃ | 3 min | 1 |
| Denaturation | 94℃ | 30 sec | 25-35 |
| Annealing | 55-68℃[1] | 30 sec | |
| Extension | 72℃ | Variable[2] | |
| Final Extension | 72℃ | 5-10 min | 1 |
[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。
[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。
3. 分析结果
将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要，可进行割胶回收。
无产物或产物量少的改进措施有：1调整退火温度；2减少抑制剂的影响，如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分，需要高倍稀释(1: 10000)后使用；3采用乙醇沉降洗脱，提高模板DNA的纯度；4使用PCR添加剂，如PCR Enhancer(Cat. #：P9041)、MgCl2(Cat. #：P9031)等可提高产量。
操作注意事项
1 室温下Pfu DNA聚合酶有一定的活性，为避免发生非特异性扩增，请于冰上配置反应体系，并且最后添加Pfu DNA聚合酶或模板DNA。
2 Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端，可直接用于平末端连接。如要进行TA克隆，请先进行加A反应，以提高克隆效率。(加A反应：参考如下体系，72℃，15-30min)
| PCR(纯化)产物 | 1-7 μl |
| 10× Taq Buffer(Mg2+ Plus) | 1 μl |
| dATP | 0.2 mM |
| Taq DNA聚合酶 | 5U |
| 超纯水 | To 10 μl |
3 碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。
4 dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。
引物设计注意事项
引物长度一般在15-30个碱基之间；上下游引物3’末端避免互补，避免出现3个以上重复的G或C，或出现发夹结构，否则会产生非特异性扩增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量尽量接近；Tm值控制在55-65℃之间，且上下游引物Tm值尽量接近，额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列，不参与Tm值计算。
