一、MTT简介
    MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。其CAS编码298-93-1。

    MTT是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

    二、MTT能做什么

    简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

    MTT主要有两个用途：

    1、药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定；

    2、细胞增殖及细胞活性测定。

    三、MTT溶液的配制

    通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，须用PBS(磷酸缓冲液)或生理盐水做溶剂。

    1、对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20m1PBS来溶解。具体做法：预先在5 0ml离心管(没有的话，可用培养瓶替代)加入20m1 PBS，从中先吸取500-1000u1 PBS装入含MTT的小管中，吹打若十次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22 um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10u1计算，一般每96孔板约击1m1，所以分装时可考虑每管分装1 ml。

    2、对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

    3、配制MTT时用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60度水浴助溶。PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调PH 7.4，定容至1L。

    注意事项：

    (1) 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

    (2) 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

    (3) MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内有效，或配制成Smg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

    (4) MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套。

    四、MTT步骤：

    1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

    2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

    3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

    4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

    五、MTT注意事项：

    1、选择适当得细胞接种浓度。

    2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

    3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

    4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。

    IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

    举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中：Xm:lg 最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值。公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 。

    Pm=0.95；Pn=0.06；P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1；Xm=lg0.1=-1；lgI=lg0.1/0.01=1；lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025；IC50=0.00025

    例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ，加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。

    一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150μl DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

    一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%(Annexin V)，细胞周期的亚G0峰比较明显。

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